Itachi Uchiha nació dentro del prestigioso Clan Uchiha, siendo el hijo mayor del líder del clan, Fugaku Uchiha, y su esposa Mikoto Uchiha. Desde muy joven, Itachi fue reconocido y elogiado como un genio excepcional, superando las expectativas de cualquier miembro experto del Clan Uchiha. Sin embargo, su brillantez también lo aisló, pues ni su familia, amigos o profesores lograban comprenderlo plenamente.
La tragedia marcó su infancia cuando, a la edad de cuatro años, presenció la pérdida de numerosas vidas durante la Tercera Guerra Mundial Shinobi. Estas experiencias traumáticas lo convirtieron en un pacifista y, en un momento dado, incluso lo llevaron a considerar el suicidio. A pesar de su corta edad, a los siete años se graduó de la Academia Ninja como el primero de su clase, demostrando una habilidad sin precedentes.
Su padre, Fugaku, veía en Itachi el futuro del clan y, en consecuencia, descuidó a su hijo menor, Sasuke Uchiha. Mientras tanto, el Clan Uchiha planeaba un golpe de Estado contra Konoha. Itachi, en su rol de miembro de ANBU, recibió la orden de espiar a su propio clan. Consciente de que un golpe de Estado solo desembocaría en otra guerra devastadora, Itachi comenzó a transmitir información al Tercer Hokage y a los ancianos de Konoha, actuando como un doble agente.
Sus acciones comenzaron a levantar sospechas dentro del clan. Itachi dejó de asistir a las reuniones, criticó los ideales del clan y fue señalado como el principal sospechoso de la muerte de su mejor amigo, Shisui Uchiha, quien se había sacrificado para proteger su Sharingan de Danzo Shimura. Ante esta situación, el clan perdió la fe en Itachi, y su padre centró su atención en Sasuke.
Los esfuerzos del Tercer Hokage por negociar una solución pacífica fracasaron. En contra de sus deseos, Danzo Shimura y el Consejo de Konoha ordenaron a Itachi exterminar a todo el Clan Uchiha. Antes de cumplir con esta terrible misión, Itachi descubrió la existencia de un supuesto Madara Uchiha, quien buscaba reavivar la guerra. Itachi y este individuo llegaron a un acuerdo: Itachi masacraría a su clan a cambio de que Madara no volviera a atacar Konoha.
Junto a Madara, Itachi aniquiló a su clan en una sola noche, salvando únicamente a Sasuke. Para proteger a su hermano y mantenerlo alejado de la oscuridad, Itachi se presentó ante él como un villano, afirmando haber matado a su familia solo para probar sus habilidades. Sasuke, enfurecido, despertó su Sharingan por primera vez e intentó atacarlo, pero Itachi esquivó sus embestidas. Al recoger su banda ninja caída, Itachi derramó lágrimas ante su hermano antes de dejarlo inconsciente. Al despertar en el hospital, Sasuke solo recordaba la promesa de venganza que le había hecho a su hermano y su deseo de restaurar la gloria del Clan Uchiha.
Itachi, sabiendo que Konoha aún podría considerar a Sasuke una amenaza, solicitó al Tercer Hokage que lo protegiera. Incluso amenazó a Danzo, advirtiéndole que no dañara a su hermano o revelaría secretos de Konoha a naciones enemigas. Una vez asegurada la protección de Sasuke, Itachi cumplió su papel como el responsable de la Masacre del Clan Uchiha.
Como miembro de Akatsuki, Itachi se encontró con Orochimaru, quien intentó robar su cuerpo para obtener su Kekkei Genkai, el Sharingan. Itachi, anticipando sus intenciones, lo atrapó en un genjutsu y le cortó la mano izquierda, obligando a Orochimaru a huir de la organización.
Itachi formó equipo con Kisame Hoshigaki. Aunque inicialmente hubo tensión entre ellos, con el tiempo desarrollaron una sólida asociación, unidos por el hecho de haber traicionado a las personas más cercanas a ellos. Itachi también ayudó a reclutar a Deidara a la fuerza, venciéndolo con un simple genjutsu.
En un momento dado, Itachi contrajo una enfermedad mortal. Sobrevivía gracias a medicamentos y a su pura fuerza de voluntad, con la esperanza de vivir lo suficiente para morir a manos de Sasuke. Tras la muerte del Tercer Hokage, Itachi regresó a Konoha junto a Kisame. Su objetivo era demostrar a los ancianos de la aldea que seguía vivo y representaba una amenaza, en caso de que intentaran aprovechar la muerte de Sarutobi para eliminar a Sasuke.
Al infiltrarse en Konoha, se enfrentaron a Asuma Sarutobi y Kurenai Yūhi, a quienes derrotaron fácilmente. Posteriormente, Kakashi Hatake intervino, pero también fue vencido por el Tsukuyomi de Itachi y torturado psicológicamente. Itachi ordenó a Kisame capturar a Kakashi y eliminar al resto, pero la situación fue evitada con la llegada de Might Guy, y ambos miembros de Akatsuki se retiraron, ya que Itachi no deseaba iniciar una guerra contra toda la aldea.
Itachi y Kisame rastrearon a Naruto Uzumaki, el jinchuriki del Nueve Colas. Utilizando un genjutsu sobre una mujer atractiva, Itachi logró alejar a Jiraiya. Se enfrentaron a Naruto, pero la llegada de Sasuke interrumpió el enfrentamiento. Sasuke intentó atacar a Itachi con el Chidori, pero fue superado y atrapado en un genjutsu donde revivió el asesinato de sus padres innumerables veces.
Itachi atormentó a Sasuke física y psicológicamente, argumentando que sus poderes eran inferiores. Su objetivo era que Sasuke comprendiera la necesidad de volverse más fuerte para poder defenderse tras su muerte. A pesar de que su misión oficial era capturar a Naruto, la verdadera razón del regreso de Itachi a Konoha fue recordar a Danzo y a los ancianos que seguía vivo y que no debían atentar contra su hermano menor.
Durante la extracción del Shukaku de Una Cola de Gaara, Itachi, junto con el resto de Akatsuki, apareció. Para distraer al Equipo Kakashi y evitar que frustraran la extracción, Itachi cedió parte de su chakra para que Pain creara una copia de Yura, un espía de la Arena, que se hizo pasar por un miembro de Akatsuki.
Itachi continuó su misión de capturar a los demás jinchurikis. En una reunión, se enteró de que Orochimaru había sido asesinado por Sasuke y se le advirtió que estuviera atento, ya que él podría ser el siguiente objetivo.
Más tarde, Itachi se encontró con Naruto en un bosque. Tras un breve intercambio, Itachi atrapó a Naruto en un genjutsu y le preguntó por qué buscaba a Sasuke. Naruto respondió que lo consideraba como un hermano, lo que provocó una sonrisa en Itachi. Itachi interrogó a Naruto sobre la posibilidad de matar a su hermano si este amenazaba Konoha. Naruto afirmó que buscaría una forma de detenerlo sin matarlo, y un sonriente Itachi le cedió parte de su poder a través de un cuervo de genjutsu, deseándole que nunca tuviera que usarlo.
Itachi deshizo el genjutsu para encontrarse con Sasuke en el mismo bosque. La batalla entre los hermanos Uchiha comenzó, con Itachi demostrando una superioridad considerable y ambos utilizando sus Sharingan y genjutsus. Sasuke empleó su Chidori y shurikens, pero perdió el uso de su ojo izquierdo. Ante la aparente ambición de Itachi por sus ojos, Sasuke utilizó una transformación parcial del Sello Maldito de Orochimaru para alejarlo. Itachi, sin embargo, logró atraparlo e intentó sacarle el ojo derecho.
Sasuke liberó su Sello Maldito de Nivel Dos, y el tiempo pareció detenerse. Itachi se preparó para usar el Amaterasu, pero Sasuke lo evitó. Ambos Uchiha utilizaron el Gōkakyū No Jutsu. Sasuke cayó envuelto en llamas por el Amaterasu de Itachi, quien no deseaba ver morir a su hermano.
Agotados y sin chakra, Sasuke se preparó para lanzar su Kirin. Sin embargo, Itachi se levantó como si nada. En ese momento, Sasuke liberó a Orochimaru, quien invocó una serpiente blanca de ocho cabezas para luchar contra el Susanoo de Itachi. Itachi, al ver a Orochimaru libre, lo atacó con su Espada de Totsuka, sellando a la serpiente y a Orochimaru en un mundo de genjutsu eterno.
Itachi, a pesar de su deterioro físico, se dispuso a tomar los ojos de su debilitado hermano. Sasuke intentó atacarlo con kunais explosivos, pero fue repelido por el Espejo de Yata del Susanoo. Al intentar usar su Chokuto, fue golpeado y aprisionado por el Susanoo. Itachi colocó sus dedos en la frente de Sasuke, como lo hacía cuando eran jóvenes, y sonriendo, pronunció sus últimas palabras: "Perdóname, Sasuke. Esto es lo último."
Itachi fue resucitado por Kabuto Yakushi mediante el Edo Tensei, junto a otros ninjas fallecidos. En el anime, su ataúd fue invocado para luchar contra el Equipo Kakashi, pero el cuerpo no respondió inicialmente. Apareció brevemente entre el ejército de Kabuto, ayudando a Nagato a caminar y discutiendo cómo ambos habían sido utilizados. Itachi reconoció el poder combinado del Rinnegan de Nagato y su propio Mangekyō Sharingan, capaces de lograr casi cualquier cosa.
Durante la conversación de Nagato y Naruto, Itachi se sorprendió al saber que Naruto había dominado el poder del Nueve Colas. Usó su Elemento Fuego: Jutsu Gran Bola de Fuego contra su voluntad, pero fue dividido por la Samehada de Killer B, lo que le hizo darse cuenta de que Kisame había muerto. Más tarde, luchó contra Killer B y se enteró de que Sasuke quería destruir Konoha, a pesar de conocer la verdad. Le pidió a Naruto que no revelara esto a la aldea para preservar el honor de su clan y que se encargara de Sasuke.
Itachi usó un genjutsu sobre Killer B, pero fue liberado por el Ocho Colas. Tras la aparición de un cuervo, Itachi casi utiliza el Amaterasu, pero el cuervo aplicó un genjutsu con el Mangekyō Sharingan de Shisui, cancelando el control de Kabuto y el Amaterasu. Recuperando el control de su cuerpo, Itachi usó su Amaterasu contra Nagato y sus invocaciones. Explicó a Naruto que el cuervo poseía el Mangekyō Sharingan de Shisui y estaba programado con un genjutsu para proteger Konoha, diseñado para detener a Sasuke si intentaba obtener el Mangekyō Sharingan Eterno implantándose los ojos de Itachi. Sin embargo, debido a la reacción del cuervo al Mangekyō de Itachi, este genjutsu no podría ser utilizado hasta dentro de diez años.
Itachi salvó a Naruto y a Killer B de los ataques de Nagato utilizando su Susanoo. Se reveló que Itachi pudo evitar contraataques tras cegar al Camaleón y...